3/1 :20254

2.2.54. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ

Изоэлектрическое фокусирование представляет собой метод электрофореза, который

разделяет белки в соответствии с их изоэлектрической точкой. Разделение проводят в

нейтрализуется и миграция прекращается. Градиенты могут быть созданы в различных

диапазонах pH в зависимости от выбранной смеси амфолитов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В изоэлектрической точке молекула белка не имеет суммарного заряда и не может

перемещаться в матрице геля под действием электрического поля. Однако, перемещение

белка может происходить в результате диффузии. Градиент pH вынуждает белок оставаться в

положении изоэлектрической точки, тем самым концентрируя его; этот концентрирующий

эффект называют «фокусирование».

полос:

где:

D – коэффициент диффузии белка;

dpH/dx – градиент рН;

E – напряженность электрического поля, в вольтах на сантиметр;

электрического поля. Разрешение между полосами белка на ИЭФ геле, приготовленном с

амфолитами носителями, может быть достаточно хорошим. Улучшение разрешения может

быть достигнуто за счет использования фиксированных градиентов рН, в которых буферные

соединения, аналогичные амфолитам-носителям, сополимеризуются с гелевой матрицей.

Белки, демонстрирующие pI и отличающиеся на 0.02 единицы рН, могут быть разделены с

использованием геля, приготовленного с амфолитами-носителями, в то время как

фиксированные градиенты рН могут разделить белки, отличающиеся приблизительно на

0.001 единицы рН.

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

окрашенного белка (например, гемоглобина) в разные области поверхности геля и

приложения электрического поля: стационарное состояние достигается, когда все нанесения

дают идентичный образец полос. В некоторых протоколах на завершение фокусирования

указывает время, прошедшее после нанесения образца. Изоэлектрическое фокусирование

может быть использовано в качестве испытания на идентификацию. В этом случае

испытуемый образец, мигрирующий на геле, сравнивают с подходящим стандартным

образцом и изоэлектрическое фокусирование калибровочными белками. Изоэлектрическое

фокусирование может быть использовано в качестве испытания на предельное содержание, а

также его можно использовать при испытании на количественное содержание. При этом

плотность полосы на изоэлектрического фокусирования сравнивают, соответственно, с

Прибор для изоэлектрического фокусирования состоит из:

– управляемого генератора для создания постоянного потенциала, тока и мощности;

используют потенциалы величиной 2500 В, которые считают оптимальными для условий

работы; рекомендуется источник тока, имеющий постоянную мощность до 30 Вт;

– жесткой пластиковой камеры изоэлектрического фокусирования, содержащей

охлаждаемую пластину из подходящего материала для нанесения геля;

– пластиковой крышки с платиновыми электродами, соединенными с гелем посредством

пластинах полиакриламидного геля, которую используют, если иное не указано в частной

монографии.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЕЙ

Форма. Форма (рисунок 2.2.5.-1) состоит из стеклянной пластины (А), на которую помещена

полиэфирная пленка (В) для облегчения работы с гелем, одной или нескольких распорных

деталей (С), второй стеклянной пластины (D) и зажимов для скрепления конструкции.

7.5 % полиакриламидный гель. Растворяют 29.1 г акриламида Р и 0.9 г

метиленбисакриламида Р в 100 мл воды Р. К 2.5 объемам полученного раствора прибавляют

смесь амфолитов, указанных в частной монографии, и доводят водой Р до объема 10 мл.

Раствор тщательно перемешивают и дегазируют.

МЕТОДИКА

Форму разбирают и, используя полиэфирную пленку, переносят гель на охлажденную

подложку, увлажненную несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая

образования пузырьков воздуха. Готовят испытуемые растворы и растворы сравнения, как

указано в частной монографии. Полоски бумаги для нанесения образцов размером около 10

количеством испытуемого раствора и растворов сравнения. Также наносят указанное

количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек в качестве

раствор образца. Отрезают две полоски бумаги по длине геля и пропитывают их растворами

электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода. Составы анодного и катодного

растворов приведены в частной монографии. Эти бумажные полоски помещают на каждую

сторону геля в нескольких миллиметрах от края. Устанавливают крышку так, чтобы

электроды соприкасались с бумажными полосками (соответственно, анодным и катодным

полями). Выполняют изоэлектрическое фокусирование, применяя параметры электрического

поля, описанные в частной монографии. Когда миграция смеси стандартных белков

стабилизируется, отключают ток. Используя пинцет, удаляют полоски для нанесения

образцов и 2 электродных фитиля. Погружают гель в фиксирующий раствор для

изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле Р. Выдерживают, осторожно встряхивая,

ИЗМЕНЕНИЯ ПОДРОБНОЙ МЕТОДИКИ (ПРЕДМЕТ ВАЛИДАЦИИ)

В тех случаях, когда делается ссылка на общую методику изоэлектрического фокусирования,

изменения в методологии или методике подлежат валидации.

К ним относят:

– использование коммерчески доступных готовых гелей и наборов для окрашивания и

обесцвечивания;

– изменения в методике нанесения пробы, включая различные объемы образца или

использование шаблонов для нанесения проб, или фитилей, изготовленных не из бумаги;

– использование альтернативных рабочих условий, включая изменения электрического поля

в зависимости от размеров геля и оборудования, а также использование фиксированных

времен миграции вместо субъективной интерпретации стабильности полос;

– включение стадии предварительного фокусирования;

– использование автоматизированных приборов;

следующие критерии:

– формирование стабильного градиента рН с заданными характеристиками, оцениваемого,

– сравнение электрофореграммы, предоставленной со стандартным образцом с

электрофореграммой испытуемого препарата;

– любые другие критерии валидации, указанные в частной монографии.

– добавление мочевины в гель (обычно 3 М концентрация достаточна для сохранения белка в

растворе, но может быть использована концентрация до 8 М раствора): некоторые белки в

своей изоэлектрической точке выпадают в осадок, в этом случае в состав геля включают

мочевину, чтобы белок оставался в растворе; при использовании мочевины следует

использовать только свежеприготовленные растворы, чтобы предотвратить

карбомилирование белка;

– использование альтернативных способов окрашивания;

– использование гелевых добавок, таких как неионогенные детергенты (например,

экстремальным значением pH образцы не следует наносить близко к электродам. Во время

разработки методики аналитик может нанести белок на гель в трех местах (т.е. в середине и

на обоих концах); рисунок белка, нанесенного на противоположные концы геля, может не

совпадать.

При продолжительном фокусировании в геле может возникнуть процесс, называемый

катодным дрейфом, при котором градиент рН с течением времени уменьшается. Причины

возникновения этого процесса недостаточно ясны, но электроэндоосмос и абсорбция

углерода диоксида могут быть факторами, вызывающими катодный дрейф. Катодный дрейф

наблюдают, когда сфокусированный белок мигрирует с катодного конца геля. Для решения

этой проблемы можно использовать фиксированные градиенты pH.